miRNA RT-qPCR Detection kit
miRNA反转录/荧光定量检测试剂盒(All In One)
miRNA反转录/荧光定量检测试剂盒
目录号:71613
产品内容
保存条件
-20℃保存,有效期12个月。
产品简介
本产品包含25 rxns (20 μl/rxn)的miRNA逆转录(加尾法)和500 rxns (20 μl/rxn)的2x miRNA qPCR Mix。
本产品采用Poly(A)加尾法,以miRNA为模板,采用特殊优化预混合miRNA RT Enzyme mix(包含Poly(A)加尾酶和反转录酶)将Poly(A)加尾和反转录一步法高效完成miRNA对应的cDNA合成;miRNA检测使用2 x miRNA qPCR Mix(含有通用型ROX)。适用于Total RNA或者small RNA等包含miRNA的样品。
操作步骤:
一、miRNA 3’末端进行Poly (A)加尾 和 逆转录反应(第一链合成)
1.冰上,在RNase-Free PCR管中,加入以下组分:(先加其他组分,最后再加入miRNA RT Enzyme Mix)
注意事项:miRNA RT Enzyme Mix非常粘稠,溶液容易吸附在管壁和吸头外,导致损失,用前请点甩离心,并且避免吸头外壁沾附损失。Enzyme Mix内酶都是过量的,即使每次按照1.8μl使用,也不影响使用效果。
*在反应中使用的total RNA必须包含有小分子RNA(miRNA)。此过程也可以使用富集的miRNA,单纯miRNA无法直接用分光光度计定量,建议直接加入2μl ~5μl。可根据目的miRNA丰度决定加入量,但是对于低丰度miRNA样品而言(如血清血浆提取物),可直接加入最大体积8 μl。
2.轻柔吸打混匀,点甩离心,42℃孵育60 min,进行miRNA加尾和逆转录反应。
3. 85℃加热5 sec,终止反应。合成的cDNA反应液可放置于-20°C保存;也可以直接进行下游qPCR检测。
二、进行miRNA的荧光定量检测。
Forward Primer设计原则:(上游引物需要自备)
1.遵循引物设计的zui普遍原则。
2.以成熟的miRNA序列为基础,将U替换成T,这是最基础和zui简单的设计方法。
3.试剂盒中提供的下游引物的Tm值为65℃,设计上游引物的Tm值要尽量保证在65℃左右。
4.若按照原则2的方式直接设计的引物其Tm值过低,可以在引物的5’端添加几个碱基(最好为G或C碱基);也可以在3’端添加1个或几个A碱基;或者5’端和3’端同时修饰。
5.若按照原则2的方式直接设计的引物其Tm值过高,可以在引物的5’或3’端去掉几个碱基。
操作步骤:
1.冰上配制qPCR反应体系:(以20μl反应体系为例)
1) 推荐模板加样量为1-2μl,miRNA第一链cDNA不应超过总反应体系的10%,对于特殊的检测体系中,高含量的cDNA模板易导致非特异性扩增,根据所检测miRNA的丰度适当的稀释cDNA(10倍或者100倍)。
2) 通常推荐引物浓度为0.2 μM,就可以得到较好的结果,反应效果不佳时可在0.1 - 1.0 μM范围内进行调整。扩增效率不高的情况下,可提高引物浓度;发生非特异性反应时,可降低引物浓度,由此优化反应体系。
2. qPCR反应程序
二步法特异性高,三步法扩增效率高。
如果融链曲线较差,可以尝试两步法扩增或提高退火温度;如果因使用Tm值较低的引物等原因,得不到良好的实验结果时,可尝试加长延伸时间或者进行三步法PCR扩增。
miRNA反转录/荧光定量检测试剂盒
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