2x miRNAUniversal SYBR qPCR Mix (茎环法)

miRNA Universal SYBR qPCR Mix 荧光定量

目录号:71501

产品内容

保存条件

-20℃保存，有效期24个月。

使用前，充分融解，轻轻颠倒混匀，短期使用可放在4 ℃，避免反复冻融。

产品简介

2x miRNA Universal SYBR qPCR Mix（茎环法）是专门为茎环法miRNA定量检测而研发的新一代预混形式的荧光定量PCR检测试剂，其中的DNA polymerase采用的是抗体修饰的热启动形式，配合特殊的Buffer体系，使反应特异性更好，灵敏度更高，并能在更广的范围内进行准确定量。

预混液中含有通用型ROX，适用于所有qPCR仪，使用qPCR Mix时不需要额外添加ROX来校正仪器。

需要自备的试剂：

待检测miRNA对应的qPCR的引物

Realtime上游引物设计：

miRNA序列除去3’端6个碱基 的剩余部分作为上游引物，如miR-1的上游引物为(注意 把U改为T)：TGGAATGTAAAGAAGT.检查引物的Tm值（一般参考DNAMAN），如果Tm值较低，则在5’端加GC使Tm值接近60度。因此miR-1的上游引物可设计 为：GCGCTGGAATGTAAAGAAGT，61.4度。

下游引物是通用的，序列为GTGCAGGGTCCGAGGT。

引物设计好后，需要通过预试验检测引物的特异性。一般需要做溶解曲线来检测引物的特异性；同时最好将PCR产物进行电泳检测产物是否单一（产物长度很短，需要3%以上的琼脂糖胶）

操作步骤：

1.在室温融化2x miRNA qPCR Mix、primer（10μM）、DNA模板、ddH2O，并置于冰上备用。

2.冰上配制qPCR反应体系：（以20μl反应体系为例）

1） 推荐模板加样量为1-2μl / 20μl反应体系，cDNA原液≤总反应体系的10%。

2） 对于特殊的检测体系中，高含量的cDNA模板易导致非特异性扩增，根据所检测miRNA的丰度适当的稀释cDNA（10倍或者100倍）。

3） 通常推荐引物浓度为0.2 μM，就可以得到较好的结果，反应效果不佳时可在0.1 - 1.0 μM范围内进行调整。

扩增效率不高的情况下，可提高引物浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。

3. qPCR反应程序

注意：

1） 本产品兼容性强，绝大多数情况下使用二步法和三步法均可获得良好效果。一般来说，二步法扩增特异性高，三步法扩增效率高。如果融链曲线较差，可以尝试两步法扩增或提高退火温度；如果因使用Tm值较低的引物等原因，得不到良好的实验结果时，可尝试加长延伸时间或者进行三步法PCR扩增。

2） 根据引物的Tm值进行退火&延伸（退火）温度的设定；

3） 延伸（退火&延伸）时间的设置还需要根据您所使用的qPCR仪所需要的最短数据采集时间自行调整。

4） 融解曲线分析请以所使用的荧光定量PCR仪推荐的程序进行设定。

miRNA Universal SYBR qPCR Mix 荧光定量