miRNA Real-Time PCR Assay kit

miRNA荧光定量PCR检测试剂盒

miRNA荧光定量PCR检测试剂盒(加尾法)

目录号：71419

产品内容

保存条件

-20℃保存，有效期24个月。

qPCR Mix使用前，充分融解，轻柔颠倒混匀，短期使用可放在4 ℃，避免反复冻融。

Reverse primer(10μM )每次用完置-20 ℃保存。

产品简介

miRNA Real-Time PCR Assay kit采用SYBR Green I嵌合染料法的原理进行miRNA荧光定量检测。

其中2x Universal miRNA SYBR Green qPCR Mix是专门为miRNA定量检测而研发的新一代2x预混液，包含除引物和DNA样品以外的所有qPCR组分，可减少操作步骤，缩短加样时间，降低污染几率。其核心组分是全新的Hotmaster Taq DNA聚合酶，配合精心优化的Buffer体系，有效抑制非特异性扩增，可对宽广浓度范围的模板进行准确定量，获得稳定可靠的qPCR结果，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好等特点。

预混液中含有通用型ROX，适用于所有qPCR仪，使用qPCR Mix时不需要额外添加ROX来校正仪器。

注意：该试剂盒需要与增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒（加尾法）配套使用。

1.需要自备的试剂：待检测miRNA对应的qPCR上游引物（Forward primer）

2.待检测miRNA对应的qPCR上游引物（Forward primer）

Forward Primer设计原则：

1.遵循引物设计的zui普遍原则。

2.以成熟的miRNA序列为基础，将U替换成T，这是最基础和zui简单的设计方法。

3.试剂盒中提供的下游引物的Tm值为65℃，设计上游引物的Tm值要尽量保证在65℃左右。

4.若按照原则2的方式直接设计的引物其Tm值过低，可以在引物的5’端添加几个碱基（最好为G或C碱基）；也可以在3’端添加1个或几个A碱基；或者5’端和3’端同时修饰。

5.若按照原则2的方式直接设计的引物其Tm值过高，可以在引物的5’或3’端去掉几个碱基。

操作步骤：

1.将DNA模板、引物、2x Universal miRNA SYBR Green qPCR Mix、RNase-Free H2O溶解并置冰上备用。

2.使用时请将2 x miRNA qPCR Mix上下颠倒轻轻均匀混合，避免起泡，并经轻微离心后使用。

3.冰上配制qPCR反应体系：（以20μl反应体系为例）

1） 推荐模板加样量为1-2μl / 20μl反应体系，miRNA第一链cDNA不应超过总反应体系的10%，对于特殊的检测体系中，高含量的cDNA模板易导致非特异性扩增，根据所检测miRNA的丰度适当的稀释cDNA（10倍或者100倍）。

2） 本品中含有荧光染料Sybr Green I，保存本品或配制PCR反应液时应避免强光照射。

3） 通常推荐引物浓度为0.2 μM，就可以得到较好的结果，反应效果不佳时可在0.1 - 1.0 μM范围内进行调整。扩增效率不高的情况下，可提高引物浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。

4. qPCR反应程序

注意：

1） 绝大多数情况下，使用二步法或三步法均可获得良好效果。二步法扩增特异性高，三步法扩增效率高。如果融链曲线较差，可以尝试两步法扩增或提高退火温度；如果因使用Tm值较低的引物等原因，得不到良好的实验结果时，可尝试加长延伸时间或者进行三步法PCR扩增。

2） 根据引物的Tm值进行退火&延伸（退火）温度的设定；

3） 延伸（退火&延伸）时间的设置还需要根据您所使用的qPCR仪所需要的最短数据采集时间自行调整。

4） 融解曲线分析请以所使用的荧光定量PCR仪推荐的程序进行设定。

miRNA荧光定量PCR检测试剂盒(加尾法)