Jinshanbio CLO01-20 一步克隆试剂盒 Jinshanbio® One Step Cloning Kit 20T
产品品牌:Jinshanbio
产品货号:CLO01-20
产品名称:一步克隆试剂盒
英文名称:Jinshanbio® One Step Cloning Kit
产品规格:20T
Jinshanbio 一步克隆试剂盒
产品简介:
Jinshanbio® One Step Cloning Kit是一款简单、快速、高效的DNA定向克隆技术,可以将插入片段定向克隆至任意载体的任意位点。可以高效兼容1-5个片段同源重组,50℃反应10 - 30 min即可进行连接,适用于快速克隆,DNA定点突变等。
实验流程
1.制备线性化载体
选择合适的克隆位点,并对载体进行线性化。尽量选择无重复序列且载体克隆位点上下游20bp区域内GC含量在40%-60%之间的位点进行克隆。载体线性化方式有限制性内切酶酶切消化和反向PCR扩增。1)酶切制备线性化载体时,推荐使用双酶切线性化,线性化wan全5.1 制备线性化载体
选择合适的克隆位点,对载体进行线性化。选择载体克隆位点附近无重复序列且上下游20bp区域内GC含量在40%-60%之间的位点进行克隆。
1)酶切制备线性化载体,推荐使用双酶切方案;单酶切线性化并不影响无缝链接,但可能会有更多的环状质粒残留,增加后期克隆的筛选难度。
2)反向PCR扩增制备线性化载体,必须使用高保真DNA聚合酶进行载体扩增,以减少扩增突变的引入。PCR产物需要进行胶回收,减少环状质粒环状DNA模板的残留。
2.制备插入片段
通过在插入片段正、反向引物5,端引入15-25bp线性化载体末端同源序列,使得插入片段PCR产物5,端和3,端的末端分别带有与线性化载体的两个末端对应的wan全一致的序列。使用高保真PCR Mix完成扩增,获得PCR产物后进行琼脂糖凝胶电泳分析,并回收正确的产物片段。
插入片段正向扩增引物设计方式:
5’-上游载体末端同源序列+酶切位点(保留或删除)+基因特异性正向扩增引物序列-3’
插入片段反向扩增引物设计方式:
3’-基因特异性反向扩增引物序列+酶切位点(保留或删除)+下游载体末端同源序列-5’
3.线性化载体与插入片段浓度测定
使用NanoDrop或Qubit检测线性化载体和插入片段的浓度。
4.重组反应体系的配制
1)线性化载体和插入片段使用量计算
载体与插入片段摩尔比为1:2 ~ 1:3;当插入片段长度大于克隆载体时,将插入片段当作克隆载体,克隆载体当作插入片段计算。
2)在冰上配制反应体系:
3) 使用移液器轻轻吸打混匀并瞬时离心。
4) 50℃反应20min, 4℃维持或取出后置于冰上冷却。
5) 重组反应转化、涂板,具体方法参照感受态细胞的说明书。
产品订购信息:
Jinshanbio CLO01-20 一步克隆试剂盒 Jinshanbio® One Step Cloning Kit 20T
Jinshanbio CLO01-50 一步克隆试剂盒 Jinshanbio® One Step Cloning Kit 50T
Jinshanbio 一步克隆试剂盒
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