EndoFree Plasmid Maxi Kit
无内毒素质粒大提试剂盒
无内毒素质粒大提试剂盒(离心柱型)核酸提取
目录号:31112-10
产品内容:
保存条件:
在室温(15~25℃)干燥条件下,可保存 12个月。
RNaseA可常温运输,-20℃保存。
产品简介:
无内素质粒大量提取试剂盒可快速从100-300ml菌液中提取质粒,采用改进的 SDS-碱裂解法裂解细胞,然后离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低 pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒 DNA,再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除,最后低盐、高 pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。所得质粒可直接用于酶切、转化、PCR、RT-qPCR、测序及转染等分子生物学实验。
产品特点:
1.内毒素含量低(< 10EU/ugDNA),细胞转染效果好。
2.得率高: 150– 300ml菌液可提出多达 500– 2000ug的纯净质粒。
重要提示:
一、使用前请先检查平衡液、溶液 P2和溶液 N3是否出现浑浊,如有混浊现象,可在 37℃
水浴中加热几分钟,即可恢复澄清,不要剧烈摇晃,以免形成过量的泡沫。
二、第一次使用前请先在去蛋白液 PE、漂洗液 WB中加入指ding量无水乙醇(见瓶身标签),充分混匀,并做好标记,以免多次加入。
三、shou次使用时请先将 RNaseA全部加到溶液 P1中,混匀,每次使用后置于 2~8℃保存。
操作步骤:
1.取 150~200ml(最多300ml)过夜培养的菌液,室温 12,000xg离心1min,尽量倒干上清,收集菌体。
(注意: 如果用 50ml离心管收集菌体,离心弃上清后,在同一管内加入更多的菌液,重复步骤 1,直到收集到足够多的菌体)
2.加入 7.5ml溶液 P1,重悬菌体沉淀,涡旋震荡至che底悬浮。
(注意:如有未che底悬浮的菌块会影响裂解,导致提取的质粒浓度及纯度降低)
3.加入 7.5ml溶液 P2,温和地上下翻转 6-8次,使菌体充分裂解,室温放置 4min。
(注意:不可剧烈震荡,以免造成基因组DNA片段的污染,所用时间不要超过5min,以免质粒受到破坏,如未wan全变得清亮,可能是菌体太多,可增加溶液 P2 的用量,在后续的操作中溶液 P3 的用量也要相应增加)
4.加入 7.5ml溶液N3,立即温和地上下翻转 6-8次,充分混匀时会出现白色絮状沉淀,
然后室温 12,000xg离心 10~15min,小心取上清至新管。
(注意:加入溶液 P3后应立即混合,避免产生 SDS的局部沉淀)
5.向上清中加入 0.5倍体积的异丙醇(约 10ml),充分颠倒混匀,分两次(每次不超过 10 ml)转入吸附柱中(吸附柱放入收集管中),12,000xg离心 1min,质粒被吸附在膜上,倒掉收集管中的滤液,直到所有混合溶液通过此吸附柱。
6.可选步骤:向吸附柱中加入 10ml去蛋白液 PE,室温 12,000xg离心 1min,弃滤液。
(注意:去蛋白液 PE为浓缩液,按要求加入无水乙醇,用后应立即盖紧瓶盖,以防酒精挥发)
(注意:如果宿主菌是 endA-,如 DH5α,此步骤可省略。如果宿主菌是 endA+,如 TG1、BL21、 HB101、JM101等,此步骤不可省略,因这些宿主菌含有大量的核酸酶,易降解质粒。如果提取低拷贝质粒也推荐采用此步骤)
7.加入 10ml漂洗液 WB,室温 12,000xg离心 1min,弃滤液。
(注意:漂洗液 WB为浓缩液,按要求加入无水乙醇,用后应立即盖紧瓶盖,以防酒精挥发)
8.重复步骤 10一次。
9.将吸附柱放进收集管,室温 12,000xg离心 3min,甩干膜上残留乙醇。开盖室温晾干
3min,以免残留乙醇影响下游应用。
10.将吸附柱置于一个新的 50 ml离心管(自备)中,加入 1 ~ 2 ml的洗脱缓冲液EB,室温放置 2 min,12,000 rpm 离心 2 min,离心管底溶液即质粒 DNA。
(注意:事先在 65~70℃水浴中预热洗脱缓冲液 EB,可增加洗脱效率;
如果需要较多量质粒,可将得到的溶液重新加入吸附柱中,再次离心 1min收集;如需使用去离子水洗脱,可用 NaOH调整其 pH值在 7.0 - 8.5之间。)
无内毒素质粒大提试剂盒(离心柱型)核酸提取
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