TOPO-TA Lightning Cloning Kit
(含酶切位点)
TOPO-TA Lightning Cloning Kit-现货
目录号:42114
产品内容:
保存条件:
-20℃,存放12个月,不影响使用效果。
产品简介:
可在室温条件下,20分钟完成TA克隆或Blunt克隆,阳性率接近100%,并且免冰浴、免热激、免蓝白斑筛选,还可以连接长达10kb的DNA片段。
克隆步骤(≤3kb片段):简化步骤(≤10kb片段)--免复苏,免液体LB
1、连接:室温5分钟; 1、连接:37℃连接5min。
2、转化:室温5分钟; 2、转化:冰浴5min,42℃热激1min,冰上2min。
3、复苏:180rpm、37℃振荡培养10分钟;涂板。3、取全部菌液涂板,37℃倒置培养。
操作步骤:
1.PCR产物的制备:
a.引物要求:引物不能磷酸化。
b.酶的选择:根据需要选择DNA聚合酶,该载体兼容PCR产物的A末端和平末端。
c.电泳检测PCR产物的量和质量:
①仅有目的条带,可直接进行连接反应,无需纯化;
②如果有多条带,建议凝胶回收DNA片段(DC011-100);
③如果以质粒为模板的扩增,则必须进行凝胶回收,因为模板质粒也会长出非目的菌落。
2.连接反应:
1)室温(20℃-37℃)建立连接体系(10ul体系):
不同大小插入片段的推荐用量:
加完试剂后,轻弹管底混匀(或轻轻吹打混匀),点甩离心收集所有液体在离心管底。
2)室温(20℃-37℃)连接5分钟。连接产物可直接转化感受态细胞,或置于冰上备用。
3.转化、复苏、涂板:
1)100ul感受态细胞,置于室温解冻(约1分钟左右),轻掸几次将细胞均匀悬浮。
2)加入10ul连接液,轻轻混匀,室温(20℃-37℃)放置5分钟。
3)加入500ul平衡至室温的LB或者SOC培养基(不含抗生素),37℃180rpm振荡培养10min。
(注意:大于3kb的片段,振荡培养时间延长至30-60分钟,可以增加转化子。或者用简化步骤)
4)取200l菌液涂板(含氨苄青霉su50-100ug/ml),培养过夜。(为得到较多克隆,4000rpm离心1min,吸弃掉部分上清,保留100-150ul,轻弹悬浮菌体,取全部菌液涂板)
注意:如果使用5ul体系,各成分按照比例减半,使用次数可以加倍。
4.转化子的筛选鉴定:
本制品阳性率相当高,一般情况下,可以达到所见即所得,只要是长出来的菌落正常(不是污染的杂菌,转化子数量也不算太少),基本就包含插入。因此插入片段不超过2-3kb的情况下可以不用鉴定直接挑1-2个菌去测序。
1)菌落PCR检测:挑单菌落于10ul无菌水中,混匀,取1ul置于25ulPCR体系,用PCR引物或者M13通用引物去鉴定阳性克隆。
2)用通用M13F(-20)/M13R(-26)引物测序来确定是否含有目的克隆。
TOPO-TA Lightning Cloning Kit-现货
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