抗酒石酸酸性磷酸酶染液说明书

（tartrate-resistant acid phosphate stain, TRAP stain）

产品用途：

存在于正常人肺泡巨噬细胞等部位的TRAP和存在于细胞白血病人脾脏的TRAP均在细胞滤泡中，并不释放入血液，血液中TRAP绝大部分来源于破骨细胞。因而测量血液中TRAP可以了解破骨细胞的功能状态。本染液可用于石蜡切片、血液及骨髓涂片、细胞爬片、冰冻切片中的破骨细胞染色。

检验原理：

在酸性的缓冲液中，细胞内酸性磷酸酶催化底物水解，其生成物进而与一种稳定的重氮盐偶联，生成不溶性的偶氮染料沉淀，当底物中存在酒石酸时，该反应只出现在特异性细胞中。

储存条件及有效期：

本试剂盒室温密封保存，有效期3个月。所有应用液配置后要立即使用，当天一次用完。

所需仪器：

光学显微镜、染缸、玻片、滴管、秒表、记号笔等。

试剂组成及配制：

简明试剂组成表

具体试剂配制及操作：

一、固定液：液体，40ml×1瓶

新鲜血涂片、细胞涂片或爬片、冰冻切片用固定液固定5～10min。石蜡包埋的切片经脱腊后不需要再固定。

二、底物反应液(一)、(二)、(三)、(四)的组成及配制：

●底物反应液(一)组成及配制

组成：(1)A粉×1支 (2)B液500ul×1支

(3)C粉×1支 (4)D液500ul×1支

配制：临用前将B液用移液器吸入A粉中充分溶解配成甲液，备用

再将D液移液器吸入C粉中充分溶解配成乙液，备用

zui后将甲液与乙液混合成底物反应(一)，备用

●底物反应液(二)组成及配制：

组成：(1)E粉×1支 (2)F500ul×1支

配制：临用前将底物反应液二的F液移液器吸入E粉中充分溶解配成底物反应液(二)，备用。

●底物反应液(三)：G液1ml×1支，备用

●底物反应液(四)组成及配制：

组成：(1)H粉×1支 (2)I液500u l×1支

配制：临用前将I液移液器吸入H粉中充分溶解配成底物反应液四，备用

底物孵育液的配制：

染色缸染色孵育法：

①将底物反应液(一)、(二)、(三)、(四)的备用液混合并充分混匀，

②先在染缸内加30 ml蒸馏水，37℃水浴10分钟，

③将底物反应液(一)、(二)、(三)、(四)依次加入已预温的蒸馏水中，

④然后将样本玻片固定,水洗后还末*干前,，立即将样本玻片放入已准备好的反应孵育液中，避光孵育60分钟。

三：复染液：苏木素液，10ml×1瓶

甲基绿液，10ml×1瓶

孵育完后，取出水洗1分钟，在玻片尚未*干之前进行复染。

可用苏木素复染1-2分钟，或用甲基绿复染2～3分钟，两者取其一

样本染色前处理及染色：

血涂片及骨髓涂片

1、推片：取全血或骨髓3微升左右置载玻片上，将推玻片保持与载玻片30度角，置于血滴正前方，稍往后移与血滴接触，血滴沿推片下缘散开，再匀速沿载玻片平面平稳向前滑动，至血液铺完血膜为止。满意效果为不太薄，以免细胞太少，也不要太厚，以免太重叠。

2、凉干：使涂片在空气中自然凉干，再放入本试剂盒中的固定液内固定2~3分钟，水洗约30~60秒。

3、一定注意水洗后不要太干时放入底物液中孵育60分钟（太干后染色效果欠佳）。

石蜡切片

1、二甲苯中脱蜡5~10分钟。再换用新鲜的二甲苯，脱蜡5-10分钟。

2、无水乙醇5分钟。再90%、70%乙醇各2分钟。

3、水合：蒸馏水2分钟。

冰冻切片

1、回温：将预先制好的并保存在-20℃冰箱中的冰冻切片放置到切片架上回温^【注】 约5-10分钟。

【注】：1）可放到37℃孵箱中进行回温;

2）在37℃水浴箱中放置一个小盒子，再将从冰箱中取出的切片架放到小盒当中，目的是让冰冻切片回温到37℃。

2、水合：将回温好的切片，水中浸泡1~2分钟。

注意事项：

1、如样本为骨片的石蜡切片，要注意不可用硝酸脱钙，酸脱钙的方法对蛋白质（酶类）伤害较大，从面影响特异性酶染色，会使细胞中的特异性酶失活，导致酶不能跟底物结合，从而导致染色失败。建议使用抗酒石酸酸性磷酸酶的试剂进行脱钙，本公司有售，咨询。

2、用底物孵育液进行孵育时要注意避光。

染色结果：

阳性反应为鲜红色或深红色颗粒，定位胞浆。