微滴式数字PCR（Droplet Digital PCR）检测服务

采用目前市场上认可度最高的Bio-Rad公司的QX200微滴式数字PCR系统。微滴式数字PCR系统的工作原理为微滴发生器（dropletgenerator）将含有核酸分子的反应体系形成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子，且每个微滴都作为一个独立的PCR反应器。经PCR扩增后，采用微滴阅读仪（droplet reader）逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0（因此该技术被称为"数字PCR"），最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。

微滴化处理步骤是QX200微滴式数字PCR的关键，使得每个微小的反应体系内进行单分子或几个分子的扩增，从而在如下方面的应用中具有突出的优势：

1.靶分子具有细微差异条件下的分析，能区分1.1倍以内的浓度变化，如拷贝数变异（CNV）；

2.在野生型序列构成的遗传背景中检测低频率的突变序列，灵敏度可达0.001%；

3.可实现无需标准品的绝对定量（DNA/mRNA/miRNA/LncRNA）；

4.不依赖Ct值，不依赖扩增效率，能克服PCR抑制剂的影响。

基于Bio-Rad公司的QX200微滴式数字PCR系统，建立了探针法和染料法两种检测平台。提供核酸绝对定量、痕量核酸样品检测、低频突变检测、环境DNA检测（eDNA)、拷贝数变异检测（CNV）等微滴式数字PCR检测服务。具体检测项目如下：

1. SNV检测

单核苷酸位点变异（SNV），包括常见的点替换、插入或缺失。二代测序技术的灵敏度可达到1%，在检测的数据量上优势很大，但在检测一些背景信号很高或变异频率很低的样本时比较乏力。数字PCR的灵敏度为0.01%，甚至0.001%，对于千分之几级别的低频突变不仅可以检测到，而且能够精确定量。

2. 拷贝数变异检测（CNV）

数字PCR的“微分”技术，摆脱对Ct值的依赖，直接获取靶基因的绝对拷贝数，其检测精度远超二代测序、芯片杂交等技术平台。因此，数字PCR技术可以对NGS、aCGH的实验结果进行有效验证，作为其真实性的二次确认。同时，CN评估的主要技术瓶颈是如何在统计置信度下有效区分连续的CN。随着CV增加，目标遗传物质之间的差异百分比下降，使得CNV的检测更加困难。数字PCR系统通过在上万个微液滴中进行CNV特定片段的扩增反应，能实现对高连续拷贝数（例如5 vs 6, 甚至10 vs 11）的区分。

3. 基因融合检测

检测基因融合，一般使用免疫组化（IHC）、荧光原位杂交（FISH）和逆转录RT-PCR的方法。IHC简便易行，但灵敏度低，假阴性高，阳性判读标准因人而异。FISH作为检测的金标准，灵敏度和特异性高，但仍有较高的假阴性概率；不仅耗时长，对操作和判读的要求也很高。RT-PCR具有快速简单的特点，但因样本降解或污染也存在一定的假阳性和假阴性。数字PCR的高灵敏度、高准确度特点，加之对干扰的耐受力，可实现融合基因的精确定量。

4. CRISPR

“基因编辑”的概念随着CRISPR-Cas9技术受热捧而被大众熟知，但CRISPR-Cas9技术尚未达到百分百的成功率，基因编辑常常存在不可预期的“脱靶”效应。如何验证基因编辑的成功性数字PCR技术则可以大显身手。Broad研究所张锋团队发明了以CRISPR为基础的SHERLOCK技术，能够对核酸进行高灵敏度的定性检测，但对基因编辑效率精确定量评估时仍采用了数字PCR技术。

5. NGS验证和文库定量

NGS测序公司通常使用Qubit或荧光qPCR对NGS文库进行定量。Qubit对异源双链DNA不具有辨别力，荧光qPCR受染料的影响比较大，定量依赖扩增的效率，两者精度都不及ddPCR。除此之外，ddPCR还能获取样本的定性信息，提高NGS的成功率，并对NGS的结果进行验证。

6. miRNA精确定量

miRNA是一类长约22nt的非编码RNA，能够调控基因表达、调节细胞功能，并且受到外泌体的保护而稳定地存在于外周循环中，有望成为癌症早期检测的生物标志物。目前血液样品miRNA的分析测试主要依赖qPCR，但研究发现，血清或血浆中的miRNA qPCR测量结果出现了极高的差异性，因此，qPCR的方法不能作为血液miRNA的稳定检测标准。qPCR与数字PCR的比较实验表明，数字PCR技术不仅重复性好，准确性和可信度也更高。

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