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方法一:磁珠法提纯mRNA
一:仪器 水浴离心机 取液器 分光光度计
二:试剂 mRNA 分离系统试剂盒,异丙醇, 3MNaAC
三:磁珠法分离mRNA的原理图示如下:
四:操作
(一 )生物素标记的Oligo(dT)探针与mRNA的煺火
1:在DEPC处理过的1.5mlEppendof管中,加入0.2-1mg的总RNA和无RNase的水至终体积为0.5ml。
2:65℃加热10min
3:加入2μl生物素标记的Oligo(dT)探针和12μl的20×SSC于RNA中轻轻混匀,室温放置,逐渐冷却平衡至室温,此步操作一般需10min。
(二)亲和素顺磁磁珠(SA-PMPS)的冲洗
4:将SA-PMPS轻晃开后,放入磁性分离架中,使SA-PMPS集中于试管一则(约30秒), 小心去除上清(不用离心方法)用1.5ml0.5×SSC漂洗SA-PMPS,用磁性分离架集中磁珠,去除上清,漂洗3次。
5:将漂洗过的SA-PMPS重新悬浮于0.2ml0.5×SSC中。
杂交体的生成及漂洗
6:将上步"3"中褪火的生物素标记的Oligo(dT)探针,全部加到上步"5"管中,轻轻混匀,室温放置10min。每隔2分钟轻轻混匀一次
7:用磁性分离架捕获磁珠,吸弃上清。
8:用0.3ml0.1×SSC漂洗SA-PMPS,用磁性分离架集中磁珠,吸弃上清,漂洗4次。
(三)洗涤收集mRNA
9:将漂洗过的SA-PMPS重新悬浮于0.2mlDEPC水中。
10:用磁性分离架捕获磁珠,将洗脱的水相吸至一新管中。重复洗涤一次,吸取水相,两次水相合并(约0.25ml)
11:在洗脱液中加入0.1体积的NaAC,1体积的异丙醇,-20℃沉淀过夜,12000g 离心10min,75%乙醇洗沉淀,真空干燥。
12:提取mRNA质量的分光光度计检测,将所提mRAN分别在260,280nm比色,要求A:OD260%/ OD280%不小于2.0及40μg所提样品在OD260%的值为1 .
13:提取mRNA质量的电泳检测,在1%的变性胶上,EB染色后,mRNA应在0.5-8Kb间均匀着色,1.5-2Kb间着色较强。
方法二:亲和柱层析法提纯mRNA
该方法利用mRNA上的寡聚A可与较联寡聚T的纤维素柱在高盐下以碱基配对形式发生亲和吸附,而在低盐下,碱基配对能力破坏,吸附解除,而其他成分的RNA则不具该特性,因此在高盐下当RNA抽提样品流经该柱时,mRNA被挂在柱上,而其他RNA则随高盐溶液流出;当用低盐洗脱液洗柱时,mRNA随洗脱液流出。再用有机溶剂沉淀则可得纯化mRNA。
一:仪器,层析系统,其他同方法一
二:试剂,
柱材Oliga(dT)-纤维素
上样液:20mMTris-HCL(pH 7.6)
0.5M NaCL
1mM EDTA (pH 8.0)
0.1% 十二烷基肌氨酸钠(SLS)
洗脱液:10mM Tris-HCL(pH 7.6)
1mM EDTA(pH 8.0)
0.05% SDS
三:操作
1:DEPC处理层析柱
2:0.1M NaOH处理Oliga(dT)-纤维素
3:用1×上样液洗柱至pH< 8.0
4:无菌水溶解RNA,65℃温浴5分钟后,迅速冷却至室温,加等体积2×上样液,上样,分部收集。
5:1倍体积1×上样液洗柱,分部收集。
6:OD260沉淀收集液,确定收集液的该值是否接近0,如该值仍很大,则上样液继续洗柱,直至该值接近0。
7:2-3倍柱床体积的洗脱液,洗柱,分部收集。
8:测定各收集管的OD260,将有吸光值的各管合并。
9:进行方法一的“11-13”步。
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