产品英文名称：Fluorescein Labeling Kit-NH2

产品中文名称：荧光素标记试剂盒- NH2

Fluorescein Labeling Kit-NH2 产品特性

整个标记过程仅需1个小时

整个标记过程在1支过滤管中进行

荧光标记抗体回收率高

适用于50-200 μg的IgG

Fluorescein Labeling Kit-NH2 产品描述

该试剂盒主要用于制备用荧光素标记的蛋白质，如免疫转染中的IgG和胞内蛋白示踪。氨基反应型荧光素是试剂盒的成分之一，它含有琥珀酰亚胺基（NHS），能与蛋白质或者其它分子的氨基反应。该试剂盒中包含了标记所需的全部试剂，包括Storage buffer。每一管荧光素最多能够标记200 μg的IgG，每个IgG分子可与4-6个荧光素分子共价结合。该试剂盒还包含一个缓冲液交换系统，因此含有氨基缓冲液的样品也能用此试剂盒来标记。虽然用膜来过滤有时会导致IgG聚集，但是试剂盒中的缓冲液交换系统能够防止标记过程中聚集现象的发生。用该试剂盒标记的抗体在4℃下能够保存至少2个月。被荧光素标记后的IgG的激发和发射波长分别为495 nm和520 nm。

Fluorescein Labeling Kit-NH2 试剂盒内容

NH2-reactive fluorescein……3管

Filtration tube……3管标记

WS buffer…………4 ml × 1瓶

Reaction buffer……………… 0.5 ml × 1管

标记IgG操作步骤：

（1）将100 μl WS buffer以及含有100 μg IgG的样品溶液加入到过滤管中。a）

（2）8,000-10,000 g离心10分钟。 b）

（3）将10 μl DMSO加入到NH2-reactive Fluorescein中并用移液器吹打使其溶解。c）

（4）将100 μl Reaction buffer以及8 μl NH2-reactive Fluorescein溶液加入到过滤管中，

吹打使其混合。d）

（5）将过滤管放入培养箱中，37℃培养10分钟。

（6）将100 μl WS buffer加入到过滤管中8,000-10,000 g离心10分钟，b）除去滤液。

（7）将200 μl WS buffer加入到过滤管中8,000-10,000 g离心10分钟，b）重复该步骤一次。

（8）将200 μl WS buffer加入到过滤管中吹打10-15次来回收标记产物。e）将该溶液转移到0.5 ml试管中， 在0-5℃下保存。

a）样品溶液的体积不应超过100 μl。如果抗体浓度低于1 mg/ml，重复步骤1和2直至总的IgG聚积量达到100 μg。如果聚积过程中滤液的体积超过400 μl，则在进行后续的离心操作前应除去滤液。

b）如果溶液在离心后仍然残留在膜上，可以再离心5分钟或者适当增加转速。

c）NH2-reactive Fluorescein在管子的底部，向管底加入10 μl DMSO，吹打数次使其溶解，如果没有DMSO的话，可以用乙醇来替代。

d）如果IgG的量为200 μg，在步骤4时加入所有的NH2-reactive Fluorescein溶液。

e）并不一定要使用WS buffer来回收标记产物，可以选择任何适合于该实验的缓冲液来替代。

Fluorescein/IgG比率的确定：

测定荧光素标记抗体溶液在280 nm以及500 nm处的吸光度，用以下公式计算比率：

比率（每个IgG分子结合的荧光素分子数）=3×A500/（A280-0.2×A500）

A500：500 nm处的吸光度 A280：280 nm处的吸光度

Fluorescein Labeling Kit-NH2 注意事项

用该试剂盒标记的蛋白质的分子量要>50,000。

在标记过程中，IgG或者Fluorescein -IgG标记物始终存在于Filtration tube的滤膜上。

如果IgG溶液中含有分子量>10,000的其他蛋白质，如BSA或明胶时，在使用该试剂盒标记前，先要纯化IgG溶液。IgG溶液能够用IgG Purification Kits（不包含于本试剂盒 中）来纯化。

如果IgG溶液含有小的不溶物，离心后取上清液来进行标记。

如果长时间不使用，建议您把试剂盒中的标记试剂NH2-reactive fluorescein放在-20℃冰箱中保存，不需要充氮气，可以更好地保持标记试剂的活性，但请不要把其它试剂和过滤管放到-20℃冰箱中，仍请放在0-5℃冰箱中保存。