金山科研平台授权一级代理，咨询微信：jinshanbio 金山禾斗石开平台供应Western blotting检测试剂盒（DAB） 品牌SGGGO QQ：1749072012 P0910量大优惠，咨询 ： 1215878164

试剂盒组成1. 封闭试剂：30g（可配制400ml）脱脂奶粉及其他蛋白，缓冲盐等混合物。2. 10倍浓缩抗体稀释液，50ml。3. HRP标记二抗，0.5ml，效价1：400。4. DAB显色液（20×），5ml A+5ml B。

原理：

SDS-PAGE电泳后，蛋白质按照分子量大小分离，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）后，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶标记的第二抗体起反应，经过底物显色以检测电泳分离的特异性的蛋白。

操作步骤：

常规电泳转膜后，1） 清洗转印膜：将膜剥离下后，作好标记，一般在左上角剪一缺口。室温用TBS-T漂洗3次每次5min,以尽量洗去转印膜上的SDS，防止影响后面的抗体结合。2） 按5g封闭试剂加100ml双蒸水计，配制膜封闭液，配好的膜封闭液为乳白色悬液，将漂洗过的转印膜，封闭液内，摇床震动，室温封闭30min。 A@ 3） 用TBS-T ，PH7.6洗液，室温漂洗3次每次5min。3）将10×抗体稀释液用双蒸水稀释成1×（10ml 10×抗体稀释液加入90ml双蒸水，混匀，可4℃保存三个月）。此稀释液可作为一抗和二抗的稀释液。4）用1×的抗体稀释液稀释抗体。根据用量以及一抗的推荐稀释浓度来稀释一抗。将杂交膜放入杂交袋中，加入一抗工作液，封口，4℃孵育过液或37℃摇动孵育2h。此用过的抗体一般可回收第二天再使用一次。注：如果所加一抗不同，可在此步将膜沿电泳方向剪成条，分别作好标记，分开孵育。5）用TBS-T ，PH7.6洗液，室温漂洗3次每次5min。6）用稀释好的抗体稀释液稀释抗体。根据用量，按10ml抗体稀释液加入10ulHRP标记二抗的比例，配制二抗工作液。将杂交膜放入杂交袋中，加入加入二抗工作液，封口，4℃孵育过液或37℃摇动孵育2h。此用过的抗体一般可回收第二天再使用一次。7）用TBS-T ，PH7.6洗液，室温漂洗3次每次10min。8）配制DAB显色：根据用量，取TBS-T 4ml，加入DAB显色液A、DAB显色液B各200ul，混匀，加在膜正面，室温下显色。在目标条带显出后，而且背景未出时，放入水中终止显色。

注意事项：1， 请根据一抗来源选择试剂盒。括号里面代标一抗的来源而不是标本的来源。2， western blotting DAB显色法操作简单，但其敏感性与ECL发光发有一定的差距，一般只适用于丰度较高的蛋白。3， 可以根据显色结果来优化实验反应时间。如背景过深，可延长膜封闭时间，加长zui终漂洗次数与时间。如果条带过弱，可延长抗体孵育时间。4， 如果*没有条带，请检查前期蛋白处理及实验过程，如果确认无误，反复两次依旧无结果，请换用ECL发光法显色。5， TBS-T（0.01M）配制方法：称取NaCl 8.5g ，Tris 1.21g ，用800ml的双蒸水溶解，用盐酸调PH到7.6，再加入0.5ml Tween－20，用双蒸水 加至1000ml，混匀即可。（也可按照自己的配制习惯来配制）

金山科研平台授权一级代理，咨询微信：jinshanbio 金山禾斗石开平台位于北京市海淀区，是一家专业从事生化试剂、分子生物学试剂、实验耗材及实验仪器研发、销售、服务为一体的生物科技公司，公司主要经营的进口品牌包括Qiagen, Omega, Sigma, Invitrogen, Roche, Abcam, Santa cruz, Fermantas（MBI）, NEB, BD, Peprotech, Abnova, R&D systerms, GE, Biovision, Millipore, Amresco, Merck, CST, Axygen, Corning, NUNC, Thermo fihser, Eppendorf等；产品涉及化工原料、生化试剂、分子克隆相关试剂、细胞培养及检测常用试剂、实验室常用耗材及仪器。

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