Western blotting检测试剂盒（ECL发光） 品牌SGGGO QQ：1749072012 P0960

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Western blotting ECL发光法检测试剂盒

试剂盒内容：1. 封闭试剂：30g（可配制400ml）脱脂奶粉及其他蛋白，缓冲盐等混合物。2. 10倍浓缩抗体稀释液，50ml。3. HRP标记二抗，0.1ml，效价1：2000-5000。4. ECL显色液，25mlA+25mlB。

试剂盒原理：SDS-PAGE电泳后，蛋白质按照分子量大小分离，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）后，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶标记的第二抗体起反应，加入发光底物后，能让胶片感光。zui后经显影和定影后，可以在胶片上显示出条带来（抗原所在位置）。

操作步骤：常规电泳转膜后，1.清洗转印膜：将膜剥离下后，作好标记，一般在左上角剪一缺口。室温用TBS-T漂洗3次每次5min,以尽量洗去转印膜上的SDS，防止影响后面的抗体结合。2.按5g封闭试剂加100ml双蒸水计，配制膜封闭液，配好的膜封闭液为乳白色悬液，将漂洗过的转印膜，封闭液内，摇床震动，室温封闭30min。用TBS-T ，PH7.6洗液，室温漂洗3次每次5min。3.将10×抗体稀释液用双蒸水稀释成1×（10ml 10×抗体稀释液加入90ml双蒸水，混匀，可4℃保存三个月）。此稀释液可作为一抗和二抗的稀释液。4.用1×的抗体稀释液稀释抗体。根据用量以及一抗的推荐稀释浓度来稀释一抗。将杂交膜放入杂交袋中，加入一抗工作液，封口，4℃孵育过液或37℃摇动孵育2h。此用过的抗体一般可回收第二天再使用一次。注：如果所加一抗不同，可在此步将膜沿电泳方向剪成条，分别作好标记，分开孵育。5.用TBS-T ，PH7.6洗液，室温漂洗3次每次5min。6.用稀释好的抗体稀释液稀释二抗。根据用量，按10ml抗体稀释液加入5ulHRP标记二抗的比例，配制二抗工作液。将杂交膜放入杂交袋中，加入二抗工作液，封口， 37℃摇动孵育1h。此用过的抗体一般可回收第二天再使用一次。7.用TBS-T ，PH7.6洗液，室温漂洗3次每次10min。8. 配制ECL发光液：根据用量，取ECL发光液A、ECL发光液B各等量，混匀，加在膜正面，暗室显色5分种。先倾去显色液，再小心用纸吸去显色液，在上面盖一层平整的透明纸。再取出感光胶片，做好标记，轻轻的放在膜上，请小心不要错动（余下的胶片请收好）。显色30S到1分种，取出（直接上抬）胶片立即*浸入显影液中1-2min，再丢入定影液中1分钟，离开暗室，观察结果，根据条带强弱，可再次感光一次，并且减短或者加长感光时间（从5秒到30分钟）以期达到理想结果。

注意事项：1. 请根据一抗来源选择试剂盒。而不是标本来源来洗择。因为二抗是与一抗反应而不是与标本反应。2.western blotting ECL发光法操作比较烦琐，但其敏感性较高，对于低丰度蛋白也能显示出结果。3.可以根据显色结果来优化实验反应时间。如背景过深，可延长膜封闭时间，加长zui终漂洗次数与时间。如果条带过弱，可增加抗体浓度，延长抗体孵育时间，加长感光时间。4. TBS-T（0.01M）配制方法：称取NaCl 8.5g ，Tris 1.21g ，用800ml的双蒸水溶解，用盐酸调PH到7.6，再加入0.5ml Tween－20，用双蒸水 加至1000ml，混匀即可。（也可按照自己的配制习惯来配制）如果实验结果无条带，可将稀释过的一抗再作1倍，10倍，50倍稀释，直接点到膜上（10ul），封闭，加二抗，zui后显色，如果能显出斑点来，则证明显色系统没有问题，可从蛋白裂解和一抗上面找原因；如果无法显出，请先从显色系统寻找原因。