谷胱甘肽-琼脂糖凝胶 H.P. C10H17N3O6S

谷胱甘肽-琼脂糖凝胶H.P.用于分离纯化谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签蛋白、其它来源的谷胱甘肽S-转移酶以及和谷胱甘肽具有亲和作用的蛋白的亲和层析介质。pGEX载体表达的外源蛋白与谷胱甘肽S-转移酶融合，因此可以通过谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析进行纯化。GSTs是一类以谷胱甘肽（γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸）作为底物，通过形成硫醇尿酸失活毒性小分子的酶。由于GST对底物的亲和力是亚毫摩尔级的，可以用含游离谷胱甘肽的缓冲液洗脱结合GST融合蛋白。基质：6%琼脂糖凝胶配基：肝素颗粒大小：45-165μm大流速：600cm/h工作pH：3-12每毫升蛋白结合量：10mg操作温度：室温保存条件：贮存于4°C-28°C（保存溶液为20%乙醇）谷胱甘肽树脂的处理:1. 轻轻颠倒盛有谷胱甘肽-琼脂糖树脂的容器，将树脂混成匀浆。2. 取部分匀浆放入15mL聚丙烯管（每100mL 细菌培养物大约需要2mL 匀浆）。3. 4℃ 500 g离心5分钟，小心去掉上清。4. 在树脂中加入10倍柱床体积预冷的PBS，颠倒数次混匀，4℃ 500 g离心5分钟，小心去掉上清。5. 每毫升树脂加入1毫升冷的PBS，制成50%匀浆，颠倒数次，混合均匀，悬液冰上放置待用。制备细胞抽提物：1. 每100毫升培养物的细胞沉淀重悬于4mL PBS缓冲液中。2. 加入溶菌酶至终浓度为1mg/mL,冰上放置30分钟。3. 用针筒将10mL 浓度为0.2%的TritonX-100 强行注入黏稠的细胞裂解物中，剧烈振动数次混匀。加入DNase和RNase至终浓度5ug/mL, 4℃振动温育10分钟，4℃ 3000 g离心30分钟，去除不溶性细胞碎片，上清转移到一只新管中，加入DTT至终浓度1mmol/L。纯化融合蛋白1.细胞裂解物与适量50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混和，每100毫升细菌培养物加2mL树脂，于室温轻摇30min。2. 混合物于4℃以500 g离心5分钟，小心去掉上清并留样少许进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。3. 沉淀中加入10倍柱床体积的冷的PBS，颠倒离心管数次混匀，洗去未与树脂结合的蛋白。4. 4℃以500 g离心5分钟，小心去掉上清并留样少许进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。5. 结合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脱液洗脱，也可用凝血酶、肠激酶或Xa 因子切割，释放靶蛋白。用谷胱甘肽洗脱融合蛋白：1. 沉淀中加入1倍柱床体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液，室温轻轻搅动10min，洗脱树脂上结合的蛋白。2. 4℃以500 g离心5分钟，上清（含洗脱的融合蛋白）移至新管中。3. 重复步骤5和6两次，合并3次上清。蛋白酶解从结合的GST融合蛋白上回收靶蛋白：4. 在结合了融合蛋白的树脂中加入凝血酶、肠激酶或Xa 因子（根据融合蛋白中的位点选择），每mL树脂加入50单位溶于1mLPBS的蛋白酶。颠倒离心管数次混匀，室温下振荡2-16小时。5. 4℃以500 g离心5分钟，上清小心移至新管中。（GST仍结合在树脂上，而靶蛋白在上清中，蛋白酶也在上清中，仍需要分离）6. 10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析每一步样品的蛋白质组成。试剂配制：谷胱甘肽洗脱缓冲液：10mmol/L还原型谷胱甘肽，50mmol/L Tris-Cl (pH8.0)