谷胱甘肽-琼脂糖凝胶 4B C10H17N3O6S

pGEX载体表达的外源蛋白与谷胱甘肽S-转移酶融合，因此可以通过谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析进行纯化。GSTs是一类以谷胱甘肽（γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸）作为底物，通过形成硫醇尿酸失活毒性小分子的酶。由于GST对底物的亲和力是亚毫摩尔级的，因此谷胱甘肽固化于琼脂糖形成的亲和层析树脂对GST及其融合蛋白的纯化效率很高。可以用含游离谷胱甘肽的缓冲液洗脱结合GST融合蛋白。树脂用3mol/L NaCl的缓冲液再生。谷胱甘肽琼脂糖对GST融合蛋白的结合能力很强（每毫升柱床体积的树脂能结合8毫克融合蛋白）。

特性: 粒度：45-165µm 流速：75cm/h 工作PH：4-10 耐压：0.3Mpa 载量：＞5mg 谷胱甘肽 S-转移酶

使用说明：

谷胱甘肽树脂的处理:

1.轻轻颠倒盛有谷胱甘肽-琼脂糖树脂的容器，将树脂混成匀浆。

2.取部分匀浆放入15mL聚丙烯管（每100mL 细菌培养物大约需要2mL 匀浆）。

3.4℃ 500 g离心5分钟，小心去掉上清。

4.在树脂中加入10倍柱床体积预冷的PBS，颠倒数次混匀，4℃ 500 g离心5分钟，小心去掉上清。

5.每毫升树脂加入1毫升冷的PBS，制成50%匀浆，颠倒数次，混合均匀，悬液冰上放置待用。制备细胞抽提物：

6.每100毫升培养物的细胞沉淀重悬于4mL PBS缓冲液中。

7.加入溶菌酶至终浓度为1mg/mL,冰上放置30分钟。

8.用针筒将10mL 浓度为0.2%的TritonX-100 强行注入黏稠的细胞裂解物中，剧烈振动数次混匀。加入DNase和RNase至终浓度5ug/mL, 4℃振动温育10分钟，4℃ 3000 g离心30分钟，去除不溶性细胞碎片，上清转移到一只新管中，加入DTT至终浓度1mmol/L。纯化融合蛋白：

9.细胞裂解物与适量50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混和，每100毫升细菌培养物加2mL树脂，于室温轻摇30min。

10.混合物于4℃以500 g离心5分钟，小心去掉上清并留样少许进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。

11.沉淀中加入10倍柱床体积的冷的PBS，颠倒离心管数次混匀，洗去未与树脂结合的蛋白。

12.4℃以500 g离心5分钟，小心去掉上清并留样少许进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。

13.重复步骤11和12两次。

14.结合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脱液洗脱，也可用凝血酶、肠激酶或Xa 因子切割，释放靶蛋白。

用谷胱甘肽洗脱融合蛋白：

15.沉淀中加入1倍柱床体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液，室温轻轻搅动10min，洗脱树脂上结合的蛋白。

16.4℃以500 g离心5分钟，上清（含洗脱的融合蛋白）移至新管中。

17.重复步骤a和b两次，合并3次上清。蛋白酶解从结合的GST融合蛋白上回收靶蛋白：

18.在结合了融合蛋白的树脂中加入凝血酶、肠激酶或Xa 因子（根据融合蛋白中的位点选择），每mL树脂加入50单位溶于1mLPBS的蛋白酶。颠倒离心管数次混匀，室温下振荡2—16小时。用小规模实验确定精确时间。

19.4℃以500 g离心5分钟，上清小心移至新管中。（GST仍结合在树脂上，而靶蛋白在上清中，蛋白酶也在上清中，仍需要分离）

20.10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析每一步样品的蛋白质组成。试剂配制：谷胱甘肽洗脱缓冲液：10mmol/L还原型谷胱甘肽，50mmol/L Tris-Cl (pH8.0)